O chorobach metabolicznych układu kostnego

Przez całe ludzkie życie trwa proces tworzenia i niszczenia kości. Tkanka kostna cechuje się bardzo wysoką zawartością minerałów oraz dużą wytrzymałością mechaniczną. Dzięki temu szkielet spełnia w naszym ciele funkcje podporowe i lokomocyjne. Kości są również ważnym rezerwuarem minerałów, takich jak: wapń, magnez, fosfor oraz pierwiastków śladowych (fluor, stront, rad, cynk, żelazo). Zaburzenia metaboliczne tkanki kostnej są przyczyną wielu zespołów chorobowych, jak osteoporoza, osteomalacja, osteoskleroza, osteodystrofia, choroba Pageta, czy wrodzona łamliwość kości (ang. osteogenesis imperfecta – OI). Przyczyną części poważnych zaburzeń metabolicznych układu kostnego (MUK) są zmiany genetyczne, występujące na poziomie pojedynczych genów lub ich grup. Do zaburzeń tego typu należą m. in. krzywice, w tym hipofosfatemiczne i krzywice witamino-D-oporne, wrodzona łamliwość kości oraz hipofosfatazja. Choroby metaboliczne układu kostnego cechują się znaczną heterogennością zarówno kliniczną jak i etiologiczną. Częstość populacyjna tej grupy zaburzeń jest różna dla poszczególnych jednostek chorobowych. Czynniki genetyczne stanowią przyczynę krzywicy u zaledwie 13% chorych. Krzywice hipofosfatemiczne występują u 1 na 25 000 żywych urodzeń1. Równie rzadko stwierdza się zachorowania na wrodzoną łamliwość kości (1 na 15 000-20 000 żywych urodzeń2). Częstość występowania hipofosfatazji o ciężkim przebiegu wynosi w Europie 1 na 300 000 urodzeń, natomiast łagodniejszą postać tej choroby stwierdza się znacznie częściej, tj. u 1 na 6 370 pacjentów3.

Niestety, tradycyjne metody diagnostyki molekularnej zaburzeń kostnych o podłożu metabolicznym rzadko dają odpowiedź na pytanie o to, co jest bezpośrednią przyczyną choroby. Wyjątek stanowi diagnostyka genetyczna hipofosfatazji powodowanej mutacjami w genie ALPL3 oraz krzywic hipofosfatemicznych, w przypadku których u zdecydowanej większości chorych stwierdza się mutacje w genie PHEX4. W przypadku pozostałych jednostek chorobowych znaczna heterogenność genetyczna sprawia, iż rutynowa diagnostyka molekularna, polegająca na sekwencjonowaniu metodą Sangera poszczególnych genów zaangażowanych w rozwój choroby, staje się trudna i nieopłacalna. Dzięki rozwojowi technik analizy genomu coraz większa grupa pacjentów ma szanse na precyzyjną diagnozę, a część z nich także na skuteczną terapię. Przeprowadzenie precyzyjnej analizy genomowej (WGS) u chorego i jego rodziców, w części przypadków umożliwia rozpoczęcie leczenia objawowego zapobiegającego wystąpieniu odległych powikłań. W wybranych sytuacjach (np. w hipofosfatazji) możliwa jest terapia celowana, polegająca na substytucji brakującego enzymu (ERT, czyli tzw. enzymatyczna terapia zastępcza). Dla rodziców małego pacjenta duże znaczenie może mieć też informacja o prawdopodobieństwie wystąpienia choroby u innych członków rodziny, w szczególności u ich kolejnych dzieci.

W ramach Ogólnopolskiego Programu Diagnostyki i Leczenia Chorób Genetycznych, który dedykowany jest osobom cierpiącym na choroby metaboliczne układu kostnego, przeprowadzana jest zaawansowana analiza całego genomu. Badanie dla wybranych pacjentów jest całkowicie bezpłatne. Rodziców lub opiekunów prawnych pacjentów spełniających kryteria rekrutacyjne prosimy o kontakt za pośrednictwem formularza zgłoszeniowego lub na adres e-mail chorobymuk@mnm.bio

Sekwencjonowanie całego genomu

Standardowe postępowanie w poradnictwie genetycznym oraz w procesie diagnostycznym wrodzonych chorób rzadkich obejmuje klasyczne metody cytogenetyki i biologii molekularnej: badanie GTG, FISH, MLPA, sekwencjonowanie Sangera oraz różne odmiany reakcji PCR. Nowoczesne metody o wysokiej przepustowości (HT, HTS) takie jak mikromacierze CGH i sekwencjonowanie egzomowe (WES) są dostępne dla niewielkiej grupy pacjentów, lecz mimo ich niezaprzeczalnych zalet cechuje je szereg ograniczeń metodologicznych. Mikromacierze są narzędziem zgrubnym, pozwalającym na identyfikację dużych zmian typu CNV i niezrównoważonych rearanżacji chromosomowych. Z kolei badanie WES, z uwagi na konieczność “wyłowienia egzonów” z puli DNA, pozwala jedynie na wykrycie niewielkich wariantów genetycznych (indel/SNV) w obrębie sekwencji kodujących, nie dając nam informacji o zmianach liczby kopii (CNV) oraz rearanżacjach chromosomowych [1]. Co więcej, sekwencjonowanie egzomowe nie pozwala na otrzymanie pełnej informacji o sekwencji kodującej nawet dla 16% genów. Z uwagi na konieczność hybrydyzacji DNA w celu wyłowienia egzonów zaburzone zostają stosunki ilościowe między poszczególnymi fragmentami genów, niektóre z nich mogą wręcz zostać pominięte. Dodatkowo w bibliotece egzomowej pewna frakcja fragmentów DNA będzie słabo reprezentowana lub nieobecna z uwagi na wysoką zawartość par GC i występowanie sekwencji o niskiej złożoności. Fenomen ten doskonale obrazują badania Meienber i wsp, w których analizowane były egzomy 5 pacjentek przy pomocy zbliżonych, dobrej jakości metodyk WES I WGS [2].

Dowiedziono w nich, że metoda sekwencjonowania całego genomu (WGS) jest wiarygodniejszym narzędziem, pozwalającym na pełniejszy opis zmian genetycznych w obrębie egzomu, przy jednoczesnej detekcji zmian typu CNV i dużych rearanżacji chromosomowych.

Rycina A: Nierównomierne pokrycie egzomu w badaniu WES w porównaniu z jednorodnym pokryciem w WGS,  nawet dla egzonów bardzo bogatych w GC.

Rycina B: Procentowy udział kompletnych sekwencji genów i egzonów w wynikach WES i WGS przy pokryciu >13X według baz ACMG, HGMD i RefSeq. [2]

Potwierdzają to badania nad techniką WGS Stavropoulosa i wsp. na grupie 100 pacjentów, zakwalifikowanych również do badania aCGH. Wykazały one wyższość sekwencjonowania nad techniką mikromacierzową w identyfikacji CNV i pozwoliły opisać podłoże genetyczne chorób rzadkich u dwukrotnie większej liczby pacjentów pediatrycznych [3]. Do podobnych wniosków doszła grupa kanadyjska, która uzyskała niemal dwukrotnie lepsze wyniki (41% vs 24%) metodą WGS niż innymi metodami, w tym  panelowym NGS oraz aCGH. Grupa ta sugeruje nawet, że WGS powinien w niedalekiej przyszłości stać się genetycznym testem pierwszego rzutu [4]. Kolejne doniesienia potwierdzają skuteczność WGS, np. w identyfikacji genetycznego podłoża defektów okulistycznych [5] czy też tkanki łącznej [6]. Wykazano użyteczność tej metody także w odniesieniu do diagnostyki noworodków hospitalizowanych w oddziałach intensywnej opieki medycznej [7].

Skuteczność metod opartych o NGS w diagnostyce chorób rzadkich

Wklejony_obraz_10_10_2019__16_58

Porównanie skuteczności metod diagnostycznych, wyrażonej odsetkiem probantów, u których udało się daną metodą wykryć podłoże genetyczne choroby.
Sekwencjonowanie całego genomu jest najskuteczniejszą ze wszystkich dostępnych metod diagnostycznych. Znormalizowane dane wg badań Lionel i wsp. [4].

Liczba doniesień wykazujących ogromną wartość techniki WGS w praktyce klinicznej stale rośnie. W niedalekiej przyszłości możemy spodziewać się podsumowania projektu “100000 Genomes Project” (https://www.genomicsengland.co.uk/), współrealizowanego przez NIH, brytyjskie National Health Service i Wellcome Trust Institute. Ambitny projekt, mający na celu zsekwencjonowanie i analizę 100 tysięcy genomów osób z wrodzonymi chorobami rzadkimi i nowotworami został zakończony sukcesem pod koniec 2018 roku, a wszystkie dane zostały w lipcu tego roku zdeponowane do publicznego użytku.

Jak zgłosić pacjenta do programu?

Lekarz może zgłosić udział pacjenta w Programie. W takim przypadku prosimy kierować zgłoszenia bezpośrednio na adres mailowy chorobymuk@mnm.bio. Prosimy o załączenie poniższych dokumentów:

  • skany dokumentacji medycznej,
  • klauzulę informacyjną RODO podpisaną przez rodzica/opiekuna prawnego pacjenta,
  • oświadczenie lekarza o uzyskanej zgodzie rodzica/opiekuna prawnego pacjenta na przetwarzanie danych osobowych pacjenta.

Klauzulę, oświadczenie oraz informację o Programie można pobrać tutaj.

Sequence your genome

We are glad you want to use our services. Let us know about your needs, we will get back to you ASAP!

Form is temporarily not available. Please visit our contact page.
X
CONTACT US